فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)
تعداد صفحات:147
پایان نامه کارشناسی ارشد
مهندسی شیمی- بیوتکنولوژی
فهرست مطالب:
فصل اول 1
1 مقدمه 2
فصل دوم 7
مروری بر مفاهیم و مطالعات انجام شده 7
2 پیش گفتار 8
2.1 آنزیم.. 8
2.2 تاریخچه آنزیم 9
2.3 آنزیم لیپاز 10
2.4 تفاوت آنزیم لیپاز و کربوکسیل استراز 11
2.5 علل افزایش توجه محققان به آنزیم لیپاز 11
2.6 واکنش‌های آنزیم لیپاز 12
2.7 ویژگی‌های آنزیم لیپاز 14
2.7.1 خاصیت ساختاری (حضور درپوش بر جایگاه فعال) 14
2.7.2 فعال سازی سطحی 15
2.7.3 گزینش پذیری سوبسترا 16
2.7.4 مقاومت در برابر افزایش دما و تغییرات(pH) 19
2.8 تولید آنزیم لیپاز 20
2.8.1 منابع تولید آنزیم لیپاز 20
2.8.2 مقایسه لیپازهای باکتریایی و قارچی و کاربردهای آن‌ها 22
2.8.3 لیپازهای قارچ‌های رشته‌ای 23
2.8.4 جداسازی آنزیم‌ها 24
2.8.5 رشد میکروارگانیسم و القا آنزیم 26
2.9 تثبیت سلولی 27
2.9.1 مقایسه مزایا و معایب تثبیت آنزیم و سلول 27
2.9.2 کاربری آنزیم یا سلول تثبیت یافته 29
2.9.3 روش‌های تثبیت سلول 30
2.9.4 انتخاب نگاه‌دارنده و روش به منظور تثبیت سلولی 36
2.9.5 مکانیسم تراوشی و جایگاه لیپاز در سلولی قارچ رایزوپوس اوریزا و اثر تثبیت بر تراوش آن 42
2.10 روش‌های سنجش فعالیت آنزیم لیپاز 45
2.10.1 روش‌های سنجش فعالیت آبکافت آنزیم لیپاز 45
2.10.2 روش‌های سنجش فعالیت سنتزی آنزیم لیپاز 46
2.11 کاربردهای آنزیم لیپاز 47
2.12 واکنش‌های سنتز استر 49
2.12.1 پارامترهای موثر بر پیشرفت واکنش سنتز استر 51
2.12.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات 54
فصل سوم 62
مواد و روشها 62
3 پیش گفتار 63
3.1 مواد شیمیایی 63
3.2 وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده 64
3.3 میکروارگانیسم 65
3.4 شرح انجام آزمایش‌ها 66
3.4.1 کشت جامد میکروارگانیسم 66
3.4.2 تولید محلول اسپور قارچ 66
3.4.3 کشت مایع میکروارگانیسم 68
3.5 تهیه بیوکاتالیست سلولی 68
3.5.1 اسفنج لوفا به عنوان نگاه‌دارنده سلولی 68
3.5.2 تثبیت قارچ رایزوپوس اوریزا و تهیه بیوکاتالیست 68
3.5.3 تعیین میزان آب بیوکاتالیست سلولی 70
3.6 رسم منحنی رشد میکروارگانیسم رایزوپوس اوریزا به فرم آزاد 70
3.7 فعال سازی غربال‌های مولکولی 71
3.8 روش کدورت سنجی سنجش اسیدهای چرب آزاد 71
3.8.1 تهیه محلول معرف استات مس- پیریدین 72
3.8.2 رسم منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد جهت سنجش فعالیت استریفیکاسیون 72
3.9 سنجش فعالیت ویژه آنزیم 73
3.9.1 فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)-تولید استر 74
3.9.2 فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی) 75
3.10 واکنش سنتز استر 1-بوتیل اولئات 75
3.10.1 آنالیز جهت تعیین پیشرفت واکنش 76
3.10.2 آنالیز محصول تولیدی به روش کروماتوگرافی گازی- اسپکتروسکپی جرمی 76
3.11 انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال 77
3.11.1 سنتز استر 1- بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان 77
3.11.2 سنتز استر 1- بوتیل اولئات در عدم حضور حلال 78
3.11.3 مقایسه اثر محدودیت‌های انتقال جرمی درون قطعه لوفا، بر سرعت اولیه واکنش در حضور حلال و عدم حضور حلال............. 78
3.12 بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان 81
3.12.1 بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش 81
3.12.2 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی 81
3.12.3 سوبسترای اسیدی 82
3.12.4 بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش 82
3.12.1 بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش 83
3.12.2 بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی 83
فصل چهارم 84
نتایج و تحلیل ها 84
4 پیش گفتار 85
4.1 منحنی رشد رایزوپوس اوریزا 85
4.2 بررسی و مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته 86
4.2.1 فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی) 86
4.2.2 فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)- تولید استر 88
4.3 انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال 89
4.3.1 سنتز استر 1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان 89
4.3.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات در عدم حضور حلال 91
4.3.3 مقایسه پارامتر انتقال جرم درونی قطعه لوفا در حضور و عدم حضور حلال 92
4.4 بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان 97
4.4.1 بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش 97
4.4.2 بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش 99
4.4.3 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی 100
4.4.4 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا اسیدی 101
4.4.5 بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش 103
4.4.6 بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی 105
نتیجهگیری و پیشنهادات 107
5 پیش‌گفتار 108
5.1 نتیجهگیری 108
5.2 پیشنهادات جهت مطالعات آتی 111
5.2.1 بیوکاتالیست 111
5.2.2 بستر واکنش 112
5.2.3 شرایط واکنش 112
5.2.4 محصول 113
منابع و مراجع 114
پیوست 114
فهرست اشکال صفحه
شکل 2 1- اثر کاتالیست بر انرژی مورد نیاز جهت آغاز واکنش 8
شکل 2 2- نمایش جایگاه فعال آنزیم و نحوه انجام واکنش کاتالیستی 9
شکل 2 3- جایگاه آنزیم لیپاز بر اساس طبقه بندی (IUBMB) 10
شکل 2 4- شماتیک واکنش تعادلی هدرولیز(از سمت چپ) استریفیکاسیون (از سمت راست) در حضور لیپاز 13
شکل 2 5 - ساختارفضایی از نمای بالا آنزیم لیپاز گونه Mucor meihei را نمایش می دهد که با تغییر قطبیت مناطق مختلف رنگ آمیزی شده است(آبی تیره-آبی کم رنگ-سفید-قرمز-قرمز تیره). ترکیبات کربنی و سولفور گستره غیر قطبی و ترکیبات نیتروژنی و اکسیژنی سبب ایجاد بخش های قطبی می شوند. درشکل 2-با افزایش قطبیت در اطراف جایگاه فعال درپوش کنار رفته و جایگاه فعال(رنگ زرد) قابل دسترس است[18]. 16
شکل 2 6-شماتیکی از عملکرد آنزیم های غیرگزینشی مکانی[19]. 17
شکل 2 7- دیاگرام روش‌های جداسازی آنزیم برون سلولی و درون سلولی از سلول و محیط کشت[25] 25
شکل 2 8- دسته بندی روش‌های تثبیت سلولی[37]. 30
شکل 2 9-نمایی از تثبیت به روش جذب سطحی[36] 31
شکل 2 10-تثبیت به روش کوالانسی[36] 32
شکل 2 11-به دام انداختن در شبکه متخلخل [36] 33
شکل 2 12- کپسوله کردن سلول ها 34
شکل 2 13- روش تثبیت با استفاده از اتصالات جانبی[36] 34
شکل 2 14- تجمع طبیعی سلول ها[36] 35
شکل 2 15 –شکل سمت چپ گیاه لوفا،شکل وسط میوه خشک شده گیاه،شکل سمت راست نمای داخلی لوفا[41] 40
شکل 2 16-شکل1- قطعه کامل لوفا؛2-مقطع عرضی لوفا،3- ساختار میکرونی لوفا در cm1؛ 4-مقطع عرضی لوفا در مقیاس mm 0/1؛ 5-مقطع عرضی در مقیاس mm 0/01 در شکل 4و5 تغیرات خواص فزیکی لوفا قابل مشاهده است[42]. 41
شکل 2 17-شماتیکی از موقعیت ایزوآنزیم های لیپاز در سلول رایزوپوس اوریزا و مکانیسم ترشح لیپاز به خارج از سلول[5] 43
شکل 2 18- شکل A - تولید لیپاز در کشت سلول به فرم آزاد ، شکل B به فرم تثبیت یافته[5]. 44
شکل 2 19- شماتیک ژن کامل لیپاز و شکست آن به ژن آنزیم31 ROL و34 ROL [5]. 44
شکل 2 20- واکنش کندانسیشن اسید و الکل در حضور کاتالیست اسیدی و یا آنزیمی 49
شکل 2 21- استر 1-بوتیل اولئات 54
شکل 2 22-شماتیک نقطه ابری لحظه تشکیل کریستال های جامد 57
شکل 2 23-نقطه گرفتگی فیلتر ضخیم شدن و تجمع کریستال های جامد 58
شکل 2 24- نقطه ریزش ایجاد کریستال های فشرده و تشکیل ژل 58
شکل 2 25- حضور روان ساز در ترکیب پلیمری سبب بهبود انعطاف پذیری آن می شود[78]. 60
شکل 2 26- شماتیک از حضور مولکول روان ساز در ترکیب پلیمری 61
شکل 3 1- تصویر سمت چپ شماتیک قارچ رایزپوس اوریزا با بزرگ نمایی اسپور های جنسی و غیر جنسی [80]. شکل سمت راست تصویر تهیه شده توسط میکروسکپ دوربین دار در مقیاس 400X از اسپور میکروارگانسم رایزپوس اوریزا پس از کشت هفت روز. 65
شکل 3 2-تصویر 1- کشت اسلنت 7 روزه پوشیده از اسپور تصویر 2- سطح جامد 7 روزه پوشیده از اسپورهای سیاه رنگ تهیه شده در مقیاس 100 X توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-4 66
شکل 3 3- دیاگرام روش شمارش اسپور با استفاده از لام نئوبار[82] 67
شکل 3 4- تصویر 1- محلول اسپور رقیق شده قارچ رایزوپوس اوریزا-تصویر 2- شمارش محلول اسپور توسط لام نئوبار (تصاویر توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-4 در مقیاس1000X تهیه شده است(. 67
شکل 3 5-قطعات لوفا 1/5cm بریده شده به فرم دیسکی 68
شکل 3 6-تصویر1-سمت چپ قطعه لوفا دیسکی،وسط بیوکاتالیست سلولی تثبیت یافته قبل از خشک شدن (مورفولوژی پلتی قابل مشاهده است)، سمت راست بیوکاتالیست سلولی پس از خشک شدن- تصویر 2-شبکه سلولزی لوفا قبل از فرایند تثبیت سلول –تصویر 3- شبکه سلولزی لوفا پس از تثبیت سلول(تصاویر 2و3 تصاویر توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-4 در مقیاس32X تهیه شده است) 69
شکل 3 7-کشت 120 ساعت رایزوپوس اوریزا 70
شکل 3 8- غربال مولکولی 3A با دانه های 2mm 71
شکل 3 9-تصویرسمت راست محلول استات مس پیریدین-تصویر وسط کمپلکس اسید چرب آزاد با محلول معرف- تصویر سمت چب رنگ سبز حاصل شده از حضور اسیدهای چرب در محلول آلی در مقابل عدم حضور اسید چرب در محلول(بی رنگ) 72
شکل 3 10- طیف رنگی حاصل از ترکیب اولئیک اسید با استات مس-پیریدین 73
شکل 3 11- منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد به روش مرجع[52] 73
شکل 4 1 منحنی رشد قارچ رایزوپوس اوریزا در دمای30 °C و دور150 rpm تلقیح یافته توسط محلول اسپور (spore/mL ) 108×5 در محیط کشت پایه قارچ 86
شکل 4 2- مقایسه فعالیت آبکافت درون سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد سلول قارچی رایزوپوس اوریزا 87
شکل 4 3- مقایسه فعالیت آبکافت خارج سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد سلول قارچی رایزوپوس 87
شکل 4 4-مقایسه فعالیت سنتز درون سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد قارچ رایزوپوس اوریزا 89
شکل 4 5 بازده و سرعت واکنش سنتز استر در برابر پیشرفت زمان در غلظت0/3Mو دمای 37°C دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا 90
شکل 4 6 بررسی سرعت و بازده واکنش در عدم حضور حلال 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور یک قطعه لوفا در دمای 50°C - منحنی داخلی مقایسه بازده واکنش در حضور و عدم حضور حلال 91
شکل 4 7 سرعت اولیه واکنش و بازده بر حسب دمای واکنش در سیستم بدون حلال در حضور 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور یک عدد لوفا 94
شکل 4 8-سرعت اولیه واکنش سنتز استر در برابر دما در غلظت0/3Mو دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا 95
شکل 4 9 بررسی اثر افزایش سرعت چرخش بر سرعت اولیه واکنش در عدم حضور حلال در سیستم بدون حلال در حضور 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور 1 عدد لوفا 96
شکل 4 10 بررسی سرعت چرخش محلول بر سرعت اولیه واکنش حلال در حضور 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، در دمای37 °C در حضور دو لوفا. 97
شکل 4 11 سرعت اولیه واکنش بر حسب تغیررات مولی سوبسترا به حلال-منحنی داخلی درصد بازده نهای بر حسب تغییرات مولی سوبسترا به حلال؛ در محلول 10mL هگزان نسبت 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول ، 98
شکل 4 12- بررسی اثر افزایش غلظت کاتالیست(تعداد لوفا) بر سرعت اولیه و(منحنی داخل) واکنش و بازده واکنش دمای 37°C دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا 100
شکل 4 13 بررسی اثر افزایش غلظت 1-بوتانول در اولئیک اسید ثابت بر سرعت اولیه واکنش و بر باززده نهایی واکنش(منحنی داخلی) در 10ml حلال ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا 101
شکل 4 14 بررسی اثر افزایش غلظت اولئیک اسید در مقدار ثابت 1-بوتانول ،بر سرعت اولیه واکنش و بازده نهایی(منحنی داخلی) در 10ml حلال، ا-بوتانول 0/3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا 102
شکل 4 15- بررسی اثر اضافه کردن جاذب بر بازده واکنش در حضور حلال با نسبت 1:1 سوبسترا 103
شکل 4 16-اثر وزن غربال ملکولی بر بازده واکنش در حضور حلال محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0/3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا 104
شکل 4 17 - اثر افزودن مرحله ای غربال ملکولی بر بازده واکنش در حضور حلال، محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا و 1/5 g غربال ملکولی-علامت فلش نشان دهنده مراحل اضافه کردن غربال ملکولی را نشان می دهد. 105
شکل 4 18-بررسی تغییرات نسبی بازده نهایی واکنش در استفاده پی در‌پی از بیوکاتالیست سلولی محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا و 1/5 g غربال ملکولی 106
فهرست جداول صفحه
جدول 2 1-مقایسه خواص آنزیم لیپاز و استراز[14] 11
جدول 2 2- مزایا و معایب روش‌های تثبیت[38] 36
جدول 2 3 - نکات قابل ملاحظه در انتخاب نگاه دارنده[37] 36
جدول 2 4- خواص فیزیکی برخی از پایه‌های نگه دارنده استفاده شده جهت تثبیت سلول[39] 39
جدول 2 5- جدول 2 6-کاربردهای صنعتی آنزیم لیپاز به تفکیک نوع صنعت[18] 48
جدول 3 1- مواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش‌ها 63
جدول 3 2- مشخصات میکروارگانیسم 65
جدول 4 1- مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته 88
جدول 4 2- مقایسه ضریب تاثیر انتقال جرم در حضور حلال و عدم حضور حلال 92
چکیده
آنزیم لیپاز کربوکسیلیک استر هیدرولازی است که بر روی‌تری آسیل گلیسیرول جهت آزاد سازی اسیدهای چرب،گلیسریدها و گلیسیرول عمل می‌کند. کشف توانایی لیپاز جهت کاتالیز واکنش استریفیکاسیون، فصل گسترده‌ای را در زمینه کارایی‌های این آنزیم آغاز کرد. در این مطالعه با آگاهی از توانایی تولید آنزیم لیپاز متصل به غشا سلولی توسط گونه قارچی رایزوپوس اوریزا، منحنی رشد میکروارگانیسم جهت تعیین مدت زمان رشد لگاریتمی و تعیین زمان تولید بهینه آنزیم لیپاز رسم شد. فعالیت سنتزی و آبکافتی برای دو فرم رشد؛ غوطه ور و تثبیت یافته بر پایه سلولزی لوفا، بر حسب مدت زمان رشد محاسبه شد. فعالیت آنزیم متصل به غشا تولیدی توسط گونه تثبیت یافته پس از به حداکثر میزان خود در طول دوره کشت خواهد رسید. سلول‌های تثبیت یافته در مدت زمان 48hr جهت کاتالیز واکنش سنز استر 1- بوتیل اولئات ، در سیستم بسته ، در حضور وعدم حضور حلال هگزان استفاده شد. سیستم شامل هگزان با بهبود پارامترهای انتقال جرمی و سنتیکی و بازدهی 86%و جهت ادامه مطالعات انتخاب شد. سپس پارامترهای موثر بر واکنش سنتز استر در حضور حلال نرمال هگزان جهت دست‌یابی به حداکثر بازده در کم‌ترین زمان، بهینه سازی شد. واکنش تعادلی سنتز استر1- بوتیل اولئات در دمای 37°C و دور 250rpm در حضور حلال نرمال هگزان و 1/5g غربال مولکولی، در نسبت مولی1:1 واکنش دهنده‌ها با غلظت 0/3M به بازدهی بالای %95 رسید. هم چنین با استفاده از بیوکاتالیست برای 20 دوره متوالی افت بازده کم‌تر از 10% مشاهده شد.
واژه‌های کلیدی:
قارچ رایزوپوس اوریزا- آنزیم لیپاز- لوفا- استر 1- بوتیل اولئات- بهینه سازی شرایط واکنش