لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 7
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت n2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید
کاربردهای PCR
1. تشخیص بیماریها: از روش PCR برای بررسی بسیاری از بیماریها استفاده میشود. مثلا در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام میشود تا تغییر در بیان ژنها بررسی گردد. حساسیت این روش ده هزار برابر روشهای معمول است. PCR را میتوان بمنظور شناسائی میکروارگانیسمهایی بکار برد که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است از جمله میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses). در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده میشود. بدین منظور ژنهای خاصی رهگیری و تعیین مقدار میشوند. بدلیل حساسیت بالای PCR، میتوان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسمها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.
۲٫ تحقیقات جنایی (forensic analysis): در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابر این با روش PCR میتوان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکولهای ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی میشود.
۳٫ انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting): با روش PCR میتوان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.
انواع PCR
با ایجاد تغییراتی در تکنیک PCR، زمینه های کاربرد وسیعی ایجاد شده است. بعضی از انواع PCR بطور خلاصه بشرح زیر است:
۱٫ Allele-specific PCR: بمنظور بررسی تغییر در فقط یک نوکلئوتید (single-nucleotide polymorphisms) در تشخیص بیماریها و کلونینگ DNA بکار میرود.
۲٫ Assembly PCR یا (Polymerase Cycling Assembly:PCA): یک روش آزمایشگاهی برای سنتز مولکولهای DNAی بزرگ است. بدین منظور از الیگونوکلئوتیدهایی استفاده میشود که همپوشانی دارند.
۳٫ Asymmetric PCR: در این روش فقط یکی از دو رشته DNA تکثیر میشود. پلی نوکلئوتیدهای حاصل بمنظور تعیین توالی یا تولید شاخص های دو رگه مورد استفاده قرار میگیرند.
۴٫ Helicase-dependent amplification: در این تکنیک برای جدا کردن دو رشته DNA، بجای حرارت از آنزیم هلیکاز (DNA Helicase) استفاده میشود.
۵٫ Hot-start PCR: برای جلوگیری از تکثیر DNAهای ناخواسته مخصوصا در مراحل اولیه PCR استفاده میشود. بدین منظور قبل از افزودن پلیمراز، دمای محلول به نقطه ذوب (مثلا ۹۵ درجه) رسانده میشود.
۶٫ Intersequence-specific PCR: برای انگشت نگاری DNA از طریق تکثیر مناطق بین سکانسهای تکراری بکار میرود.
۷٫ Inverse PCR: کاربرد این تکنیک زمانی است که فقط یک سکانس داخلی شناسایی شده است.
۸٫ Ligation-mediated PCR: در این روش از DNAهای رابط کوچک (small DNA linkers) که به DNAی مورد نظر متصل شده اند، استفاده میشود. کاربرد این روش در تعیین توالی DNA (DNA sequencing)، genome walking و DNA footprinting است.
۹٫ Methylation-specific PCR: این تکنیک توسط Stephen Baylin وJim Herman در دانشکده پزشکی دانشگاه جان هاپکینز ابداع شده است و بمنظور بررسی متیلاسیون در قطعات CpG (CpG islands) در DNAی ژنومیک بکار میرود.
۱۰٫ Miniprimer PCR: در این روش از یک نوع پلیمراز جدید بنام(S-Tbr) استفاده میشود که قادر است به پرایمرهای کوچک ۹ یا ۱۰ نوکلئوتیدی(smalligos) متصل شود. در حالیکه Taq به پرایمرهای بزرگتری متصل میشود که حدود ۲۰ نوکلئوتید دارند. بنابر این با استفاده از S-Tbr، پرایمرهای کوچکتری را میتوان طراحی کرد.
۱۱٫ Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification: در این روش با استفاده از یک جفت پرایمر، میتوان چند نوع DNAی مختلف را تکثیر کرد.
۱۲٫ Multiplex-PCR: در این تکنیک از چند پرایمر در یک محلول PCR استفاده میشود و آمپلیکونهایی (amplicons) تهیه میشود که اندازه های متفاوتی دارند و مختص DNAهای مختلفی هستند. با هدف قرار دادن چندین ژن در یک محلول PCR، میتوان با آزمایشات کمتر و زمان کوتاهتر، اطلاعات بیشتری جمع آوری کرد.
۱۳٫ Nested PCR: در این روش از تکثیر DNAی ناخواسته جلوگیری شده اثرات زمینه ای کم میشود. بدین ترتیب در فرآیند تکثیر DNAی هدف، اختصاصی بودن (specificity) افزایش می یابد.
دانلود مقاله کامل درباره واکنش زنجیره ای پلیمراز
